如何使用全功能超微量紫外可见分光光度计
2022-06-29 09:27 普通小龙包
什么是超微量紫外可见分光光度计
超微量分光光度计是精密的光谱仪器，出厂前经过精细的调校，如果能对仪器进行恰当的维护和保养，不仅能保证仪器的重复性和稳定性，也可以延长仪器使用寿命。
超微量分光光度计常用来检测A230、A260、A280，并以此分析核酸以及蛋白的浓度和纯度，在物理学、化学、生物学、医学、材料学、环境科学等科学研究领域都有非常广阔的应用。
相较传统分光光度计，超微量分光光度计的主要特点是上样量低，仅需1滴样品（核酸样品仅需0.5微升，蛋白样品需1微升），即可完成检测。
国产自研品牌，普睿博仪器，精心打造的超微量紫外可见分光光光度计，Pono-650，采用高亮度氙灯和紫外增强型cmos以确保核酸样品以及蛋白样品的准确稳定，支持200~800 nm全波长扫描，支持自定义检测波长。同时集成比色皿OD600检测功能，可以指示细菌、酵母或细胞的生长密度，也集成了荧光检测功能，完美适配对极低浓度核酸样品的检测需求。
各种光谱仪（分光光度计）具体区别见下图。
超微量分光光度计工作原理
与传统分光度计一样，超微量分光光度计遵从郎伯比尔定律。
在检测核酸蛋白时，超微量分光光度计可以测试获得样品浓度，无需使用标准品，无需建立标准曲线。其他形式的检测则与传统分光光度计一致，需要使用标准品建立标准曲线进行测试。相关参数详解见下表。
在检测核酸蛋白时，超微量分光光度计可以测试获得样品浓度，无需使用标准品，无需建立标准曲线。其他形式的检测则与传统分光光度计一致，需要使用标准品建立标准曲线进行测试。相关参数详解见下表。
使用超微量分光光度计进行核酸检测
超微量分光光度计检测A260，并以此对核酸进行定量。通常，核酸包括dsDNA、ssDNA和RNA，他们的消光系数各不相同。进行检测时，先用溶剂进行空白检测（通常是TE缓冲液或水），再滴加0.5~2微升样品在上样台上，等待数秒即可获得检测结果。
相关参数详解见下表。
使用超微量分光光度计进行蛋白检测
超微量分光光度计检测A280，并以此对蛋白进行定量。蛋白质成分复杂，因氨基酸序列和蛋白质空间结构不同，他们的消光系数各不相同。进行检测时，先用溶剂进行空白检测（通常是PBS缓冲液或水），再滴加1~2微升样品在上样台上，等待数秒即可获得检测结果。
相关参数详解见下表。
BCA法和考马斯亮蓝法检测蛋白
超微量分光光度计可以通过BCA法和Bradford法对蛋白进行定量。需要搭配染料试剂和蛋白标准品使用，需要建立标准曲线。通常，更推荐使用酶标仪进行分析。
相关参数详解见下表。
相关参数详解见下表。
荧光法检测核酸和蛋白
通过荧光染料特异性结合DNA分子，并激发出荧光，以检测荧光强度的方式来间接定量DNA，这样获得的检测结果更加准确，且灵敏度可达0.5pg/μl(dsDNA)，检测下限极低，并可以有效避免RNA、蛋白、酚类物质、盐酸胍等物质的干扰。这种检测方法需要搭配额外的荧光染料试剂来使用。
常见核酸检测方法见下表。
常见核酸检测方法见下表。
如何评价超微量分光光度计的性能
首先是重复性检测。例如我们使用DNA样品，测A260，对一个样品进行上样/检测/清洗的操作流程，重复操作3-5次，如果重复性偏差小于3%，说明稳定性良好，结果可靠。
再者是稳定性检测。例如我们使用DNA样品，将样品稀释成不同浓度，检测这些样品得到的数据做曲线，和由稀释操作得到的理论标准模型曲线是否无限接近。表现为趋势性拟合的曲线R2是否接近1。可以认为在R2超过0.995的情况下，吸光度数据是真实随着浓度变化的，数据是可靠的。
最后是准确性检测，例如我们使用IgG标准品，当实际检测结果与标定数值有较大差异时，可判定仪器准确性有故障，可联系厂商进行校准，建议多台分光光度计进行比对，以确保标准品可靠。准确性故障多为仪器硬件老化、光源亮度变化等原因造成，不影响仪器的重复性和稳定性，通过校准即可复原，建议定期维护校准仪器。
再者是稳定性检测。例如我们使用DNA样品，将样品稀释成不同浓度，检测这些样品得到的数据做曲线，和由稀释操作得到的理论标准模型曲线是否无限接近。表现为趋势性拟合的曲线R2是否接近1。可以认为在R2超过0.995的情况下，吸光度数据是真实随着浓度变化的，数据是可靠的。
最后是准确性检测，例如我们使用IgG标准品，当实际检测结果与标定数值有较大差异时，可判定仪器准确性有故障，可联系厂商进行校准，建议多台分光光度计进行比对，以确保标准品可靠。准确性故障多为仪器硬件老化、光源亮度变化等原因造成，不影响仪器的重复性和稳定性，通过校准即可复原，建议定期维护校准仪器。
